摘要
表面等离子共振（SPR）是生物分子互作分析的核心技术，本文以连翘活性成分筛选为案例，详细讲解SPR 亲和力筛选的实验搭建、芯片偶联、垂钓富集、液质鉴定、分子模拟、动力学拟合全流程，给出可工程化复现的技术方案，适合生物信息、生物工程、药物研发工程师参考。
1 技术背景
在中药复杂体系中，传统活性筛选方法存在纯化繁琐、标记干扰、假阳性高、无法定量等问题。SPR 无标记互作技术可直接在粗提体系中实现活性成分垂钓，并定量检测亲和力（KD）、结合速率（ka）、解离速率（kd），为活性成分筛选提供客观量化指标，已成为药物研发的关键底层技术。
2 SPR 实验系统搭建
2.1 芯片与蛋白偶联
选用 CM5 传感芯片，采用氨基偶联流程：1）EDC/NHS 混合液以 10 μL/min 流速激活芯片通道；2）靶蛋白用 pH 4.0 醋酸钠稀释至 50 μg/mL，固定至芯片表面；3）乙醇胺封闭未反应位点，完成蛋白固载；4）同步构建参比通道，消除非特异性结合干扰。本实验蛋白偶联量达 8941 RU，满足后续垂钓与亲和力检测要求。
2.2 样品制备与 SPR 垂钓
称取连翘药材，水提后制成 500 mg/mL 浓缩液，经滤膜除菌后，稀释为 500、250、125 mg/mL 梯度浓度。样品以 10 μL/min 流速进样，结合 60 s，解离 60 s，重复检测，收集特异性结合洗脱液。结果显示：RU 信号随样品浓度升高而增强，呈现典型浓度依赖性结合，证明体系存在特异性互作成分。
3 活性成分质谱鉴定
将 SPR 垂钓洗脱液经甲醇复溶、超声、离心、过滤后，采用 Q Exactive Plus 高分辨液质联用仪检测，正负离子模式同时扫描，通过 Compound Discover 3.2 软件进行峰提取与结构鉴定。共鉴定出 9 种活性成分：原儿茶酸、马钱苷酸、红景天苷、断氧化马钱苷、连翘酯苷 I、毛蕊花糖苷、茵芋苷、异连翘酯苷 A、桑黄素。
4 分子水平结合验证
4.1 分子对接
对靶蛋白进行同源建模与去水优化，小分子配体进行能量最小化处理，采用 AutoDock Vina 进行对接，计算结合亲和力。筛选结合能＜-5.0 kcal/mol 的成分进入下一步模拟。
4.2 分子动力学模拟
采用 AMBER 22 进行 100 ns 模拟，蛋白用 ff14SB 力场，小分子用 gaff 力场，TIP3P 水盒子构建体系。计算 RMSD 与 MM-GBSA 结合自由能，结果显示：毛蕊花糖苷、异连翘酯苷 A、桑黄素结合自由能＜-10 kcal/mol，体系稳定。
5 SPR 亲和力定量检测（核心环节）
5.1 单点筛选
将 9 种候选成分配制成 100 μmol/L 初始浓度，进样检测结合信号。结果显示：所有成分均产生特异性结合信号，毛蕊花糖苷、原儿茶酸信号幅值最高，优先进入定量检测。
5.2 动力学与亲和力拟合
将毛蕊花糖苷倍比稀释为 0.1875~12 μmol/L 梯度浓度，以 30 μL/min 流速进样，采集结合 / 解离曲线。使用 Biacore T200 evaluation 软件，采用1:1 Langmuir 结合模型全局拟合，得到 KD=3.24×10⁻⁶ M，证明毛蕊花糖苷与靶蛋白具有高强度亲和力。
6 技术优势与工程化价值
1）无标记原位检测：直接在粗提体系筛选，无需纯化，适配中药复杂样品；2）定量亲和力输出：提供 KD、ka、kd 等关键参数，为药物筛选提供量化依据；3）高通量高效：单次可完成多组分、多浓度检测，大幅缩短研发周期；4）结果可靠：结合分子模拟与体内验证，降低假阳性。
7 总结
基于 SPR 亲和力的中药活性成分筛选体系，将生物传感、质谱鉴定、计算模拟、功能验证有机结合，形成标准化、可复现、可量化的研发流程。该方案可直接迁移至天然产物筛选、小分子互作、蛋白靶标验证等场景，是生物工程与药物研发领域的高价值技术方案。
参考文献：王琳，王平，蔡雯等。基于 SPR 垂钓技术的连翘靶向 RSV-F 蛋白 “功效物质” 筛选 [J]. 世界科学技术 - 中医药现代化，2025,27 (05):1405-1416.
