慢病毒载体伯远生物慢病毒载体

慢病毒载体伯远生物慢病毒载体

伯远生物是国家级专精特新小巨人企业，国家级重点实验室，牵头多项省部级重大专项，公司科研技术人员500+（硕博占比40%以上），作为功能基因研究综合性平台，15年技术沉淀，每年完成功能基因研究数量50000+，长期服务课题组10000+（含协和、同济、华西、湘雅、中山、军事医学院等顶尖医学研究机构），各类仪器设备投资超1个亿

案例展示

案例展示

1、慢病毒感染细胞效率实例

图 慢病毒感染细胞效率

2、慢病毒体内表达应用实例

图 慢病毒体内表达应用实例（Shi Y, et al. 2017）。

参考文献

Mátrai J, Chuah MK, VandenDriessche T. Recent advances in lentiviral vector development and applications.Mol Ther. 2010;18(3):477-490.

Shi Y, Ping YF, Zhou W, et al. Tumour-associated macrophages secrete pleiotrophin to promote PTPRZ1 signalling in glioblastoma stem cells for tumour growth.Nat Commun.2017;8:15080.

我司默认采用三质粒系统进行包毒，若为过表达慢病毒包装，则需目的基因在3000bp以内，如有个性化要求，请致电详联

背景说明

背景说明

通常，LVs是通过反式互补产生的，其表达系统由用于表达特定基因的目的质粒及病毒gag/pol、Rev和VSVG等组分的包装质粒组成，其中包装质粒提供了病毒基因组mRNA包装成完整毒粒所必需的结构蛋白、聚合酶和包膜蛋白。

LVs具有感染谱广泛、可以有效感染分裂期和静止期细胞、长期稳定表达外源基因等优点，区别于一般的逆转录病毒载体，其对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。携带有外源基因的LVs在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。

通常根据不同的实验目的针对LVs改造以进行启动子活性研究、基因表达研究、基因沉默等研究。外源基因则通过载体中的多克隆位点插入LVs以进行表达。

图 反式互补生产LVs（Mátrai et al. 2010）。

原理简介

携带有外源基因的LVs在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。

LVs包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录，并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。

通常根据不同的实验目的针对LVs改造以进行启动子活性研究、基因表达研究、基因沉默等研究。外源基因则通过载体中的多克隆位点插入LVs以进行表达。

图 慢病毒包装和侵染过程示意图

我司载体简介

我司可提供丰富的LVs产品体系，用于操作编码基因和非编码基因，如lncRNA、miRNA、circRNA。

我司原始细胞慢病毒包装载体列表，可根据不同的需求，选择不同的载体，插入不同的位置

服务流程

服务流程

客户在线下单——订单/实验材料确认——构建LVs包装载体与目的载体——共转染293T细胞——病毒上清收集——病毒浓缩和纯化——慢病毒鉴定（包括病毒滴度、质粒残留、宿主DNA残留、BSA残留、支原体检测、衣原体检测、内毒素检测、细菌及真菌检测等）——可选后续感染目的细胞及相关实验

我司默认采用三质粒系统进行包毒，若为过表达慢病毒包装，则需目的基因在3000bp以内，如有个性化要求，请致电详联

服务内容及说明

服务内容及说明

慢病毒滴度鉴定方法

适用范围

现在LV系统已经被广泛应用到各种细胞系的基因过表达、RNA干扰、miRNA研究以及活体动物实验中。

客户下单及项目信息填写

在我司官网http://www.biorun.com/进行注册或登录，请客户按照页面提示填写：目的基因信息、载体构建详情，后续感染的细胞可选自行提供或我司提供。

实验信息

实验过程中客户可以随时登入管理系统查看项目实时进展情况。实验结题时系统会通过短信自动通知客户，并发送实验报告查看网址。实验结题后，实验报告、检测结果可在线查看或打印，并永久保留。

实验周期

致电详询

实验交付内容

1、所有实验的原始数据（包括实验过程、实验试剂与设备等）；

2、重组载体的全序列信息和注释信息；

3、重组载体的酶切图谱；

4、重组载体测序结果；

5、引物序列；

6、病毒质控鉴定报告与结果分析（包含滴度鉴定、BCA检测、支原体检测等可选）；

7、高滴度慢病毒载体（不低于108TU/mL）；

8、阴性对照病毒；

9、稳转细胞株（可选）。

慢过表达载体的详细设计方案，我按“目标定义→载体骨架→表达盒设计→标签与筛选→特殊蛋白处理→验证策略”来整理，尽量写成你可以直接拿去做方案设计的版本。
1.先定目标
慢病毒载体过表达载体设计的第一步，不是选骨架，而是先明确你想回答什么问题。
如果是做功能研究，通常关注的是蛋白是否能正常表达、定位、互作和发挥生物学作用，而不只是“有没有条带”。
慢病毒载体如果是做稳定细胞系，还要考虑长期表达是否会对细胞有毒性、是否需要筛选标记、是否需要后续单克隆化。
2.选载体骨架
慢病毒载体一般优先选择成熟的哺乳动物表达载体或慢病毒过表达载体。
如果你想先快速摸底表达，瞬时表达载体更简单；如果你后面还要做稳定株、长周期表型或rescue，慢病毒载体更实用。
骨架本身最好是实验室常用、元件清楚、文献和操作经验较多的版本，避免一开始就用过于复杂的定制骨架。
3.表达盒怎么设计
过表达载体的核心表达盒通常是：启动子→Kozak→目的基因CDS→标签/连接肽→polyA信号。
如果你做的是功能研究，最好克制地加入元件，不要把表达盒堆得太复杂，因为每多一个元件，都可能带来表达下降或功能干扰。
目的基因建议优先克隆CDS，而不是基因组片段；这样更利于表达，也更容易控制阅读框。
4.启动子怎么选
启动子决定表达强度和细胞适配性。
CMV：强，适合多数细胞的瞬时高表达。
EF1α：更稳，某些细胞里比CMV更不容易沉默。
CAG：也常用于高表达场景，尤其在部分真核体系里表现很好。
如果你做的是功能研究，我一般建议先从CMV或EF1α开始，必要时做平行比较。
5.标签怎么设计
标签的选择要看你是更重视检测方便还是更重视功能不受影响。
如果是功能研究，通常优先选小标签，比如FLAG、HA、Myc或His，因为它们对蛋白本身影响相对小，也方便WB、IF、IP。
如果你后面还想纯化蛋白，His-tag最省事；如果你要做互作和免疫沉淀，FLAG/HA往往更顺手。