在蛋白质相互作用研究中，免疫共沉淀（Co-IP）能告诉你“谁和谁结合”，却无法告诉你“在哪里结合”；近年CNS等高分杂志使用的邻位连接技术（Proximity Ligation Assay, PLA）于2002年由Ulf Landegren团队提出并不断改进，能在原位将蛋白质的相互作用转化为肉眼可见的荧光信号。
邻近连接技术（Proximity Ligation Assay，PLA）是一种基于抗体识别与DNA扩增的高灵敏度蛋白质检测技术。它通过空间邻近依赖的DNA连接与扩增，将蛋白质相互作用或翻译后修饰事件转化为可定量的荧光信号。PLA最大的特点是看得见的蛋白互作，即便是微量样本、微弱或者瞬时的互作以及低丰度的表达，也能在内源水平可视化目的蛋白的互作、定位和定量。
PLA的核心原理是当两个目标蛋白（或修饰位点）的间距小于40 nm时，偶联特异性抗体的DNA探针会相互靠近，经连接酶催化形成环状DNA模板，再通过滚环扩增添加荧光信号。
具体来说是将不同种属来源的特异性抗体（一抗）结合至目的蛋白A和B，随后偶联了互补的寡核苷酸（PLA探针）的抗体（二抗）结合至一抗，然后利用滚环扩增（RCA）法进行PCR扩增，最后通过标记寡核苷酸与扩增子内的互补序列杂交，在荧光显微镜下观察PLA信号。蛋白A和B存在互作，则PLA探针足够接近可与连接子在DNA连接酶的作用下形成封闭的环状DNA，在DNA聚合酶介导的RCA扩增下合成连环序列，扩大序列信号，最终在荧光显微镜下观察到荧光信号。
1、超高灵敏度：滚环扩增实现信号放大1000倍，可检测单分子级别的目标蛋白。
2、原位可视化：直接在细胞或组织原位捕获互作事件，保留亚细胞定位信息；
3、高特异性：需双抗体+双DNA探针同时结合靶标，有效规避抗体非特异性吸附导致的假阳性。
4、样本适用广泛：适用于多种样本类型，包括FFPE组织、穿刺活检等微量样本，可兼容IF/FISH等其他标记技术。
实验流程参考Duolink® PLA实验方案
1、样品准备
培养细胞并制备细胞爬片，用4%多聚甲醛室温固定10-30 min，再用0.2% Triton X-100进行透化处理。对于石蜡包埋组织切片，需预先进行脱蜡与水化处理。
2、样本封闭
在每个样品上添加封闭液，确保覆盖整个样品，然后将载玻片置于37°C预热的湿盒中孵育30-60 min。
PS：禁止使用与一抗同物种的同型 IgG 作为封闭剂，会引发 PLA 探针非特异性结合，产生假阳性斑点信号。
3、一抗孵育
用抗体稀释液分别稀释两种一抗（必须来自不同物种，如兔源和鼠源）。吸弃封闭液后，将一抗滴加到样品上，37°C孵育2-3 h或4°C孵育过夜。
PS：两种一抗必须是不同种属，如鼠源和兔源；一抗须经过PLA、IHC、ICC或IF验证，确保高特异性。
4、PLA探针孵育
吸弃一抗并洗涤载玻片2次，每次5 min。按试剂盒说明书稀释PLUS和MINUS PLA探针并滴加到样品上，37°C孵育1 h。
5、连接反应
用纯水稀释连接缓冲液，将连接酶按说明书比例添加至连接缓冲液中。洗涤玻片后，滴加含连接酶的连接溶液，然后置于预热的湿盒中，37°C孵育30 min。
6、滚环扩增
用纯水稀释扩增缓冲液，将聚合酶按说明书比例添加至扩增缓冲液中，洗涤玻片后，滴加含聚合酶的扩增缓冲液，然后置于预测的湿盒中，37°C避光孵育100 min。
7、封片与成像
扩增结束后使用洗涤缓冲液彻底洗涤玻片，待样本自然晾干后使用含DAPI的封片剂封片，在共聚焦显微镜或荧光显微镜下采集图像。
PLA信号显示为红色，核显示为蓝色。A为阳性对照。B为没有一抗的阴性对照。
1、固定剂的选择
固定剂选择取决于样本类型，PLA兼容丙酮、乙醇、福尔马林、甲醇、多聚甲醛以及锌固定液；
2、透化处理
使抗体进入细胞结合抗原，需要根据固定方式与样本类型选择去污剂，PLA兼容Triton X-100、NP40、Tween-20和洋地黄皂苷等去污剂；丙酮和甲醇固定时会同步进行透化，无需额外透化处理。
3、抗原修复
抗原修复的目的是解除固定过程中被交联遮蔽的抗原表位；修复方式直接影响抗体结合效率。
热诱导抗原修复（HIER）：Trilogy 缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、EDTA 缓冲液、高 pH Tris 缓冲液；
酶诱导抗原修复（PIER）：蛋白酶 K、胃蛋白酶、胰蛋白酶处理。
4、封闭操作
封闭的目的是减少抗体的非特异性结合，降低背景信号。Duolink® PLA 试剂盒自带配套封闭液与抗体稀释液，可最大程度降低抗体、寡核苷酸探针的非特异性结合。
5、一抗孵育
需针对待测样本摸索一抗最优孵育条件，建议先通过 IF/IHC 完成单种一抗条件摸索；双抗体系需分别单独优化两种一抗，且最终样本处理条件需同时适配两种抗体；
PS：选择抗体亚型为IgG，优先选择亲和纯化抗体，降低交叉反应；
6、对照设置
每个PLA实验都应包含阴性对照和阳性对照：
阴性对照：仅加单一一种一抗（或两种一抗都不加），用于验证信号的特异性
阳性对照：使用已知存在蛋白互作的样本，验证整个实验体系是否正常工作
7、湿盒操作
每次孵育都必须将载玻片放在预热的湿盒中进行，防止样本干涸。样本干燥会导致严重的背景信号和非特异性结合。
8、洗涤要充分
每一步孵育之后都要充分洗涤，移除未结合的抗体和探针。洗涤不彻底会显著增加背景信号。
9、避光操作
从加入荧光标记的检测探针开始，所有操作都需避光进行，防止荧光淬灭。
1、信号弱或无信号
抗体失效或特异性不足、连接酶或聚合酶失活导致，目标蛋白丰度过低会影响信号强弱。此外，固定或透化过度会抗原表位导致信号减弱或无信号。
2、背景信号过高
封闭不彻底或洗涤不充分导致；抗体或探针浓度过高以及样本干燥也会导致背景信号过高。
3、信号点过多或聚集
RCA扩增时间过久，探针浓度过高导致产物过度扩增，信号点聚集合并。图像采集时显微镜参数调整不当也会导致信号过度曝光。
