DSI523Ra01脑缺血(MCAO/R)大鼠模型
一．模型简介：
脑卒中是目前全球第三大死因，其中缺血性脑血管病占比高达60%～80%，是脑血管病的主要类型。缺血性脑血管病引起的脑损伤不仅包括缺血期的原发性损伤，还包括血流恢复后加重的继发性脑缺血再灌注损伤（Cerebral Ischemia Reperfusion Injury, CIRI）。再灌注损伤涉及自由基爆发、炎症级联反应、兴奋性氨基酸毒性、细胞凋亡及血脑屏障破坏等多重病理机制，是导致患者神经功能预后不良的重要因素。
鉴于大鼠脑血管解剖结构与人类高度相似，且大脑中动脉为血栓好发部位，大鼠大脑中动脉闭塞（Middle Cerebral Artery Occlusion, MCAO）模型已成为国际公认的研究脑缺血再灌注损伤的"金标准"动物模型。该模型采用线栓法实现血管内闭塞与再通，具有无需开颅、创伤小、无需特殊设备、梗死区域恒定等突出优势。目前，改良Zea Longa线栓法是大鼠MCAO/再灌注（MCAO/R）模型最常用的制备方法，凭借良好的稳定性和可重复性，已成为缺血性脑卒中基础研究与临床前药物评价不可或缺的平台工具。
- 材料：
1.货号：DSI523Ra01
2.实验动物：SPF级SD大鼠，雄性，周龄为6w~8w，体重为220g~250。
三．模型制作方法：
本模型推荐采用线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞/再灌注（MCAO/R）模型，具体操作步骤如下：
1.术前准备与麻醉：称量大鼠，腹腔注射麻醉大鼠，插入肛温探头，保持体温在37±0.5℃；
2.暴露动脉：颈部正中切口，暴露右侧颈总动脉，颈内动脉和颈外动脉。使用6-0丝线在距离颈总动脉分叉4mm处结扎颈外动脉远心端，在颈外动脉穿入另一根6-0丝线，在靠近颈总动脉分叉处打一个活结备用；
3.插入线栓致缺血：以动脉夹临时夹闭CCA。在距CCA分叉约3 mm处的ECA上剪一小口，将线栓由此插入，经CCA分叉进入ICA，继续向颅内推送至遇轻微阻力即止（插入深度距CCA分叉约16±1 mm），此时线栓头端恰好阻断大脑中动脉起始部；
4.再灌注与术后护理：缺血90 min后，轻轻拔出线栓至ECA残端，用6-0丝线结扎ECA近心端，缝合颈部切口，活力碘消毒。将大鼠置于加热垫上保温，待清醒后常规饲养。
图一. 线栓展示及手术操作图
四．模型评估：
为系统验证模型构建的成功性与可靠性，本平台从神经行为、梗死体积、血脑屏障功能、组织病理、影像学及分子生物学六个层面建立标准化鉴定方案，确保模型质量的可控性与可重复性。
1. 神经行为学评分（Zea Longa 5分制）
再灌注后24 h，采用Zea Longa 5分制标准进行神经功能缺损评估：
0分：无神经损伤症状
1分：缺血对侧前肢不能完全伸展
2分：行走时向对侧转圈
3分：行走时身体向对侧倾倒
4分：不能自发行走，意识丧失
判定标准：评分1～3分者视为造模成功，0分（无缺血）和4分（病情过重或蛛网膜下腔出血）者予以剔除。模型组平均评分应显著高于假手术组。
2. TTC染色测定脑梗死体积（金标准）
原理：TTC（2,3,5-三苯基氯化四氮唑）在线粒体脱氢酶作用下还原为红色脂溶性物质，正常脑组织染为红色；梗死区因脱氢酶失活而呈白色。
操作：再灌注24 h后取脑，于−20 °C速冻15 min，由前向后做连续冠状切片，厚度2 mm。将脑片置于2% TTC溶液中，37 °C避光孵育10 min，取出后以4%多聚甲醛固定。采用Image J软件计算梗死面积。
结果：模型组可见明显白色梗死灶，与假手术组（全脑均匀红色）差异显著。
3. 血脑屏障损伤鉴定
3.1 伊文思蓝（Evans Blue, EB）染色——通透性定量检测
原理：EB与血浆白蛋白结合形成大分子复合物，正常BBB无法透过；BBB损伤时复合物外渗至脑实质，通过分光光度法定量。
操作：再灌注24 h后经尾静脉注射2% EB溶液（4 ml/kg），循环2 h后行生理盐水心脏灌流至流出液清亮，取缺血侧脑组织称重，置于甲酰胺中60 °C孵育48 h提取染料，于620 nm波长测定吸光度，根据标准曲线计算EB含量（μg/g脑组织）。
结果：模型组EB含量较假手术组显著升高，表明BBB通透性增加。
3.2 脑组织含水量测定——间接反映BBB损伤所致血管源性水肿
操作：取缺血侧脑组织，精密称量湿重后置于70°C烘箱中烘干至恒重（约48h），称量干重。按公式计算含水量：含水量（%）=（湿重－干重）/湿重×100%。
结果：模型组脑组织含水量显著高于假手术组，提示BBB损伤后液体外渗导致脑水肿。
4. 脑组织病理学检查（HE染色）
典型病理改变：模型组可见神经元胞体缩小、核固缩深染、细胞周围间隙增宽（空泡化），间质水肿明显，部分区域可见炎性细胞浸润。假手术组神经细胞形态正常，结构清晰。
5. MRI活体影像学检测
T2加权成像（T2WI）评价脑水肿：采用小动物高场强MRI（如7.0 T），于再灌注不同时间点行T2WI扫描，获取冠状位及轴位图像。通过计算缺血侧脑组织T2信号强度及相对T2值，定量评估脑水肿程度。模型组缺血区T2信号明显增高，反映组织水肿及细胞毒性水肿。
6. 分子生物学检测
6.1 紧密连接蛋白表达——BBB结构完整性的分子基础
取缺血侧脑组织匀浆，提取总蛋白，采用Western blot检测紧密连接核心蛋白Occludin、Claudin-5及ZO-1的表达水平。同时可采用免疫荧光双标（如ZO-1与CD31共染）观察紧密连接在微血管内皮细胞上的分布与连续性。
6.2 炎症因子检测
通过qRT-PCR或ELISA检测缺血脑组织中TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子的mRNA或蛋白水平，模型组上述因子表达显著上调，反映再灌注诱发的炎症级联反应。
6.3 凋亡相关蛋白检测
采用Western blot检测Bcl-2（抗凋亡）、Bax（促凋亡）及Caspase-3（效应酶）的蛋白表达量，并计算Bcl-2/Bax比值。模型组Bax和Caspase-3表达升高，Bcl-2降低，Bcl-2/Bax比值下降，提示神经细胞凋亡通路激活。配合TUNEL染色可原位检测凋亡细胞数。
6.4 氧化应激指标测定
取脑组织匀浆，采用比色法检测超氧化物歧化酶（SOD） 和过氧化氢酶（CAT） 活性，以及丙二醛（MDA） 含量。模型组SOD、CAT活性下降，MDA含量升高，表明氧化-抗氧化平衡被打破。
图二.大鼠脑组织TTC染色图
图三.脑组织伊文思蓝渗漏大体图
图四.脑组织TUNEL染色结果
图五.脑组织NeuN、GFAP免疫荧光双标染色结果：
图六.WB检测脑组织中NF-κB、Claudin-5、ZO-1蛋白表达结果
综上，本平台通过行为学—宏观梗死—BBB功能—组织病理—活体影像—分子标志的六级鉴定体系，对脑缺血再灌注损伤大鼠模型进行系统而严格的质量控制，确保模型稳定可靠，为神经保护药物筛选及机制研究提供坚实的实验基础。
- 广泛的应用场景
1. 神经保护药物药效学评价
该模型最广泛的应用是筛选和评价抗脑缺血再灌注损伤的候选药物。通过观察药物能否降低模型动物的神经功能缺损评分、缩小脑梗死体积、减轻脑组织病理损伤、抑制神经细胞凋亡或改善氧化应激指标，来系统评估药物的神经保护效果。目前已在该模型上验证了众多中药复方及单体化合物的保护作用。
2. 病理生理机制研究
模型可用于探究脑缺血再灌注损伤的分子机制，如氧化应激、炎症反应、细胞凋亡、铁死亡、自噬及血脑屏障破坏等关键病理环节，为揭示CIRI的复杂网络调控机制提供在体实验依据。
3. 特定基因或信号通路研究
通过结合基因干预（如过表达、基因敲低）或通路特异性激动剂/抑制剂，模型可用于探究特定基因或信号通路在脑缺血再灌注损伤中的功能角色。
4. 模拟临床并发症与合并症
通过调整建模参数或联合其他干预手段，该模型可模拟特定的临床场景。例如，联合力竭游泳可建立“气虚血瘀型”病证结合模型；采用老龄大鼠可模拟老年脑卒中患者的病理特点；结合远程缺血预处理可研究缺血耐受机制。
5. 联合干预策略评价
模型还可用于评价药物与非药物疗法的联合干预效果，如药物联合针刺、电针、经颅磁刺激或亚低温治疗等综合治疗策略。
综上，脑缺血再灌注损伤大鼠模型经多维度鉴定确保了其可靠性与可重复性，在神经保护药物筛选、病理机制解析及转化医学研究中均具有不可替代的价值。
六．结语
云克隆（Cloud-Clone Corp.）依托成熟的实验动物技术平台，推出经严格多维鉴定的脑缺血再灌注损伤大鼠模型（货号：DSI523Ra01）。本模型采用线栓法制备大脑中动脉闭塞/再灌注（MCAO/R）模型，术后通过神经行为学评分、TTC染色测定脑梗死体积、伊文思蓝（EB）染色评估血脑屏障通透性、脑组织含水量测定反映脑水肿程度、HE染色观察组织病理学改变、小动物MRI活体影像学追踪以及Western blot检测紧密连接蛋白与凋亡相关蛋白表达等六级标准化鉴定体系，确保模型的稳定性、可靠性与可重复性。
该模型可广泛应用于神经保护药物药效学评价、CIRI病理机制解析、特定基因或信号通路功能研究以及联合干预策略评估等场景。此外，云克隆同步提供模型动物脑组织石蜡切片、血清样本采集及定制化检测服务，并可承接从模型构建、药物干预到病理分析、数据统计的全流程整体试验外包，以一站式解决方案助力您的科研进程。
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