一、文章介绍
空间转录组学（Spatial Transcriptomics, ST）技术已成为评估组织切片中基因表达的有力工具，为理解健康和疾病中的组织多样性、细胞组成和潜在机制提供了关键见解。然而，ST数据分析与可视化面临若干瓶颈：低采样量和组织形态学差异限制了统计功效并阻碍了不同实验组间的可靠比较；同时，需要可解释、全面且空间感知的基因表达模式和通路可视化方法来探究异质组织内的复杂生物学过程。
为克服这些局限，Dimitri Sokolowski、Alexander J. Trostle及其合作者在Bioinformatics上发表了题为“SpatialFlux: an R package for distance gradient analysis in spatial transcriptomics”的应用笔记，介绍了一个名为SpatialFlux的R包，旨在进行基于参考点的距离梯度分析。
SpatialFlux的核心方法建立在研究团队先前提出的参考点距离梯度分析策略之上。该策略通过选择一组空间点作为“参考点”，计算所有其他目标点相对于这些参考点的欧几里得距离，从而沿距离轴以梯度方式评估基因表达。距离梯度分析通过沿距离轴平均基因表达来最小化样本间组织架构差异，有助于获得可推广的基因和通路表达梯度，合并形态不同的多个样本以增加样本量、降低噪声、提高统计功效。
SpatialFlux的输入为标准Seurat对象（适用于10x Visium/VisiumHD数据），利用二维平面坐标(x,y)(x,y)(x,y)表示空间点的位置。参考点的选择有三种灵活策略：（1）通过包内置的交互式Shiny应用程序选择单个或多个空间点；（2）基于聚类身份选择空间点；（3）使用影像分析软件（如Fiji/ImageJ）手动绘制参考线，通过坐标文件导入。所有参考点与所有目标点之间的欧几里得距离通过d(x,y)=(xi−yi)2+(xj−yj)2d(x,y) = \sqrt{(x_i - y_i)^2 + (x_j - y_j)^2}d(x,y)=(xi−yi)2+(xj−yj)2计算，其中xxx和yyy分别为参考点和目标点坐标。每个目标点到最近参考点的最小距离（称为“spatialvalues”）存储在Seurat对象元数据中，用于初步梯度距离评估。
SpatialFlux提供两种分析模式：无偏发现模式和有偏定向模式。在无偏模式下，将spatialvalues代入Monocle3格式对象，利用其内置差异表达函数识别与距离相关的基因，再通过层次聚类识别沿距离轴具有不同峰值表达位置的基因簇，并进行GO富集分析。在有偏模式下，用户可指定特定基因或通路模块分数，沿距离轴可视化其表达变化，实现定向假设检验。
研究者使用小鼠胫骨骨折的公开10x Visium数据集（GEO: GSE218046）展示SpatialFlux的应用。通过手动选择骨折处的空间点作为参考，计算所有点至骨折线的距离，生成距离梯度可视化。差异表达分析结合层次聚类识别出5个在距离骨折线不同位置具有峰值表达的基因簇。近骨折线处上调基因富集于基质组织相关GO术语，中距离处与细胞外基质和炎症相关，远距离处与代谢过程相关。有偏分析显示，从近到远，软骨相关基因（Acan、Col2a1）迅速下降，而成骨基因（Bglap）上调，与WNT和BMP信号通路活性一致，精确复现了已知的软骨内成骨过程。在肝脏分区验证中，以Cyp2e1（经典门静脉周围标志物）为参考，SpatialFlux完全复现了从中心静脉区到门静脉区的核心信号梯度，证明其在高复杂组织架构中评估精细空间受限基因表达的能力。
二、算法原理介绍
SpatialFlux的算法原理围绕“参考点选择 → 欧几里得距离映射 → 无偏/有偏表达分析”三个核心步骤展开。
（一）参考点选择与距离计算。用户可通过三种方式定义参考点：（1）Shiny应用中点击选择空间点；（2）基于Seurat聚类标签批量选择；（3）从Fiji/ImageJ绘制的参考线提取坐标点。参考点集合R={r1,r2,...,rm}R = \{r_1, r_2, ..., r_m\}R={r1,r2,...,rm}，目标点集合T={t1,t2,...,tn}T = \{t_1, t_2, ..., t_n\}T={t1,t2,...,tn}，ri=(xi,yi)r_i = (x_i, y_i)ri=(xi,yi)，tj=(xj,yj)t_j = (x_j, y_j)tj=(xj,yj)。对每个目标点tjt_jtj，计算其到所有参考点的欧几里得距离dij=(xi−xj)2+(yi−yj)2d_{ij} = \sqrt{(x_i - x_j)^2 + (y_i - y_j)^2}dij=(xi−xj)2+(yi−yj)2，取最小值作为该点的“spatialvalues”：sj=minidijs_j = \min_i d_{ij}sj=minidij。这些值被添加到Seurat对象元数据中，作为距离梯度的定量表示。对于多张切片，距离值被归一化到同一轴，使不同形态的切片可合并分析。
（二）无偏模式：Monocle3驱动的差异表达与聚类。将Seurat对象转换为Monocle3的cell_data_set对象，以spatialvalues作为“伪时间”排序维度。使用Monocle3的graph_test()函数（基于负二项模型）检测与距离显著相关的基因（q值<0.05）。对显著基因进行层次聚类（基于表达模式的Spearman距离+ Ward链接），识别沿距离轴具有不同峰值表达位置的基因簇（默认5簇，用户可调）。每个簇的基因可导出用于GO/通路富集分析（支持clusterProfiler等工具）。
（三）有偏模式：基因和通路模块的定向可视化。用户指定感兴趣的基因列表或通路基因集，SpatialFlux计算沿距离轴的每个bin（用户定义距离区间）的平均表达或模块分数（使用Seurat的AddModuleScore或AverageExpression）。输出包括：（1）散点图显示基因表达随距离的变化趋势（可选拟合平滑曲线）；（2）热图显示多个基因/通路沿距离轴的动态变化；（3）如果有多张切片，可叠加显示均值±标准差，评估跨样本一致性。这种“对齐到同一距离轴”的策略使形态不同的切片可在相同尺度上比较，有效增加样本量并降低噪声。
三、总结
SpatialFlux是一个用于空间转录组学距离梯度分析的R包，通过选择参考点计算所有空间点到参考点的欧几里得距离，将组织形态差异“对齐”到统一的距离轴上，从而支持无偏发现（Monocle3差异表达+聚类+GO富集）和有偏定向（指定基因/通路沿梯度可视化）两种分析模式。其核心创新在于：以距离梯度代替原始空间坐标作为分析维度，使形态不同的组织切片可合并分析以增加统计功效，同时保留空间信息的生物学解读。SpatialFlux在小鼠骨折模型中精确复现了从软骨到成骨的时空转变梯度，在肝脏分区中完整重现了中心静脉-门静脉信号梯度，为空间转录组学中跨切片、跨形态的基因表达比较提供了灵活易用的计算工具。
