摘要：低浓度重组蛋白配制为液体剂型以后，可能同时面临氧化、聚集、容器吸附及活性变化等问题。细胞因子制剂的稳定性不能仅依据pH或者单一蛋白纯度指标判断，还需要结合色谱浓度、SDS-PAGE和生物学效价共同评价。Akron Bio公开的IL-7和IL-15 Closed System Solutions（CSS）制剂研究，将两种重组人细胞因子配制为0.01 mg/mL，比较不同缓冲体系和辅料组合在2–8℃条件下的稳定性。研究显示，IL-15制剂II在12个月时的RP-HPLC纯度约65%，但SDS-PAGE纯度仍约96%，其生物学活性保持在每袋约0.45至0.5 MIU；IL-7在9个月时也出现不同配方之间蛋白浓度与纯度变化不一致的现象。本文围绕这些差异，分析液体细胞因子制剂的质量指标及研究边界。
关键词：IL-15液体制剂、IL-7、细胞因子稳定性、RP-HPLC、SDS-PAGE、蛋白质氧化、蛋白质聚集、蛋白吸附、生物学效价、液体蛋白制剂、Akron CSS、T细胞培养
一、为什么液体细胞因子不能只看一个稳定性指标
在重组蛋白制剂研究中，一个常见问题是：如果储存以后蛋白质仍然能够通过SDS-PAGE检测到较完整的主条带，是否就可以认为其理化状态没有明显变化？又或者，如果RP-HPLC纯度下降，是否意味着相应蛋白质已经完全失去生物学活性？这两种理解都容易将不同检测方法所提供的信息混为一谈。
对于IL-7、IL-15等细胞因子，稳定性需要同时考虑蛋白质是否发生化学改变、可检测蛋白浓度是否下降、是否产生其他形式的杂质，以及最终是否能够在相应细胞功能测定中保留活性。不同检测方法针对的质量属性不同，因此同一制剂在不同检测指标上可能显示不同变化。
例如，RP-HPLC能够根据特定色谱条件分析蛋白质及其相关变体，SDS-PAGE主要通过电泳方式观察蛋白质相关条带，而细胞生物学效价测定则进一步反映蛋白质在既定细胞和测定体系中的功能。因此，一个指标表现稳定，不应自动替代其他指标的结果。
Akron Bio公开的IL-7和IL-15低浓度液体CSS研究提供了一个比较具体的例子：不同配方在2–8℃长期储存期间，pH、浓度、色谱纯度、电泳纯度和生物学效价的变化趋势并不完全相同。这组数据有助于理解为什么细胞因子液体制剂需要建立多维质量评价体系。
二、IL-7和IL-15为什么在低浓度液体状态下更值得关注稳定性
IL-7与IL-15均属于参与T细胞生长、存活和扩增相关过程的γc细胞因子，在工程化免疫细胞研究及细胞治疗制造流程中具有重要应用背景。传统冻干剂型通常在使用前进行复溶，而液体剂型则需要在既定包装系统中直接维持相应蛋白质状态，因此对储存过程中的化学和物理稳定性提出不同要求。
当蛋白质浓度较低时，容器表面吸附造成的相对损失可能更值得关注。同时，氧化、聚集及其他降解过程也可能改变蛋白质的可检测含量和结构。即使制剂刚配制完成时符合标称浓度，如果储存过程中的实际浓度持续下降，也会影响研究人员对该制剂的后续评价。
此次公开研究采用0.01 mg/mL作为IL-7和IL-15的目标液体制剂浓度，相当于10 μg/mL。这一数值应理解为该研究采用的具体浓度，而不是全部细胞治疗制造体系都应使用的最终工作浓度。制剂储存浓度与加入培养基以后的细胞因子使用浓度属于两个不同概念。
三、为什么需要把细胞因子稳定性放到实际包装系统中研究
液体蛋白质的稳定性不仅取决于缓冲液本身，还可能受到储存容器材料、灌装体积和蛋白质与容器表面相互作用等因素影响。如果研究只在普通实验室离心管中分析蛋白状态，所得结果不一定能够完整反映其在最终交付包装中的表现。
Akron CSS研究采用Entegris Aramus 2D一次性袋组件，将重组人IL-7和IL-15配制后直接灌装至目标容器中进行评价。IL-15长期稳定性研究采用每袋5 mL、20 mL CSS袋，IL-7则采用每袋10 mL、20 mL CSS袋。两种蛋白质都按照0.01 mg/mL标称浓度制备，并在2–8℃条件下进行相应储存研究。
这种设计使研究不只观察蛋白质在某种缓冲液中的状态，而是将实际袋装体系纳入评价。对于低浓度蛋白质，包装材料吸附可能造成可检测浓度下降，因此通过最终相关包装进行分析具有方法学意义。
不过，包装袋中形成的特定稳定性结果仍然受到包装材料、蛋白质批次、灌装条件和配方的共同影响，不应直接套用到其他容器或不同浓度的细胞因子体系。
四、同样是0.01 mg/mL IL-15，为什么三种配方初筛结果不同
研究在IL-15制剂筛选阶段设置三种配方，比较中性和酸性缓冲体系、不同去污剂以及抗氧化辅料的组合。三种制剂均包含0.01 mg的rHuIL-15原料记录，而完整研究描述的目标液体浓度为0.01 mg/mL。
| 组分 | 制剂I | 制剂II | 制剂III |
|---|---|---|---|
| rHuIL-15（mg） | 0.01 | 0.01 | 0.01 |
| 中性缓冲体系 | 有 | 无 | 有 |
| 酸性缓冲体系 | 无 | 有 | 无 |
| 去污剂1 | 有 | 无 | 无 |
| 去污剂2 | 无 | 有 | 有 |
| 抗氧化辅料 | 无 | 有 | 有 |
从配方组成看，制剂I使用中性缓冲体系和去污剂1，没有加入抗氧化辅料；制剂II采用酸性缓冲体系、去污剂2及抗氧化辅料；制剂III则采用中性缓冲体系、去污剂2和抗氧化辅料。
这样的设计可用于比较完整辅料组合的表现。制剂II与III均具有去污剂2和抗氧化辅料，主要差异在缓冲体系；但制剂I与另外两组同时存在多项组成差异，因此不适合仅根据初筛结果判断去污剂1或者缺少抗氧化辅料是造成全部不稳定现象的唯一原因。
五、为什么一个月初筛首先要同时看浓度和色谱纯度
三种IL-15制剂初筛采用配制后即刻与一个月两个时间点，使用RP-HPLC评价袋内未氧化蛋白浓度和色谱纯度，并通过对照色谱图分析变化。相关色谱资料还包括稀释液、标准品和未经配制的蛋白原液，使研究人员能够观察不同样品所对应的峰型。
结果显示，制剂I的检测浓度由约6.0 μg/mL降至一个月时约3.8 μg/mL，RP-HPLC纯度由约87%下降至约73%，并出现额外色谱峰。相比之下，一个月时制剂II的浓度约9.0 μg/mL、纯度约83%，制剂III的浓度约8.0 μg/mL、纯度约85%。
由此可见，即使三个配方在初始设计中使用相同蛋白质原料量，经过一个月储存以后，浓度和纯度可能出现明显不同的变化。对于制剂开发而言，这些结果比单独记录初始配方浓度更有意义，因为它们直接反映所测试包装与储存条件中的实际检测状态。
基于这一初筛结果，制剂II与制剂III进入后续长期稳定性研究，制剂I则未显示出相同程度的短期稳定性。
六、IL-15制剂II的HPLC纯度为什么会从85%降至65%
IL-15制剂II以0.01 mg/mL配制，按照每袋5 mL灌装在20 mL CSS袋内，在2–8℃条件下储存12个月。研究监测pH、RP-HPLC纯度和浓度，同时通过还原型SDS-PAGE评价蛋白质相关条带变化。
结果显示，制剂II的pH基本保持在6.3至6.5之间。还原型SDS-PAGE纯度在所测时间点保持90%以上，多数结果约95%至97%，12个月约96%，其中第9个月没有进行该项检测。
但RP-HPLC纯度从初期约85%下降至12个月约65%，浓度在6.7至8.6 μg/mL之间变化，12个月约6.8 μg/mL。这些数据说明，虽然制剂II在长期储存期间维持了相对稳定的pH和较高的SDS-PAGE相关纯度，但RP-HPLC检测所反映的蛋白质组成仍然发生了明显变化。
这一结果不应该被概括为“蛋白质纯度始终保持在95%以上”，因为95%至97%的描述主要对应SDS-PAGE指标，而HPLC纯度在长期储存后明显降低。不同方法提供的结构及组成信息不完全相同，二者必须并列保留。
至于为什么两种方法得到的变化幅度不同，可能与各自检测原理及相关蛋白变体的识别方式有关；但没有进一步完整分析证据时，不宜直接确定某一种具体降解产物就是全部差异的原因。
七、IL-15制剂III的pH更稳定，为什么长期蛋白损失仍然明显
制剂III使用与制剂II相同的去污剂2和抗氧化辅料，但采用中性缓冲体系，同样在0.01 mg/mL浓度下每袋灌装5 mL并开展12个月2–8℃储存研究。
结果显示，制剂III的pH保持在7.3至7.5之间，看起来具有较好的数值稳定性。但SDS-PAGE纯度在前6个月为约96%至98%，12个月降至约76%；RP-HPLC纯度从约89%降至约39%；浓度也由约8.3 μg/mL下降至约3.6 μg/mL。
如果研究人员只比较pH是否稳定，就可能错误地认为制剂III也具有充分的蛋白质稳定性。事实上，蛋白质的化学和物理变化并不必然使pH出现明显波动，因此需要通过直接检测蛋白质相关指标来判断。
在所测试的两种完整配方中，酸性缓冲体系的制剂II对IL-15表现出更好的长期浓度和纯度保持能力。但这仍属于具体配方组合和包装条件下的实验结果，并不能简单推广为所有IL-15蛋白都应使用相同pH范围。
八、IL-7两种制剂为什么会出现“纯度都高、浓度却差很多”
在IL-7研究中，制剂II和III同样配制为0.01 mg/mL，使用20 mL CSS袋，每袋灌装10 mL，并在2–8℃条件下观察9个月。
IL-7制剂II的pH约6.1，SDS-PAGE纯度约95%至96%，RP-HPLC纯度约98%至99%，9个月时检测浓度约7.4 μg/mL。相比之下，制剂III的pH约7.2，SDS-PAGE纯度约93%至94%，RP-HPLC纯度约96%至98%，但9个月时浓度降至约3.8 μg/mL。
这组数据很好地说明了浓度和纯度的区别。蛋白质纯度较高，意味着相应分析方法中目标峰或目标条带所占比例较高，但这并不能自动证明制剂中的目标蛋白总量没有变化。如果一部分蛋白在储存期间因为吸附、降解或其他机制减少，剩余可检测蛋白仍可能显示较高百分比的纯度。
因此，对于低浓度IL-7制剂，研究人员除了观察RP-HPLC纯度，还需要关注实际检测到的未氧化蛋白浓度。制剂II与制剂III之间更明显的差别之一，正是9个月时剩余可检测浓度的不同。
九、IL-7保持10 MIU以上活性，为什么仍不能忽略浓度下降
为了进一步判断蛋白质在储存以后是否仍然具备相应生物学功能，研究使用2E8细胞测定IL-7活性，并采用平行线浓度-反应分析及相关参考标准估算效价。
研究将IL-7制剂II与III均配制为0.01 mg/mL，使用每袋10 mL的灌装规格，并在2–8℃条件下储存9个月。结果显示，两种制剂在9个月时每袋生物学活性均保持在10 MIU以上。
这说明即使制剂III在第9个月的可检测浓度已经明显低于制剂II，所采用的细胞生物学测定仍可以检出相应活性。然而，这并不意味着浓度下降对剂量或产品质量没有意义，因为浓度和效价属于不同质量指标，分别回答可检测蛋白数量与特定细胞作用的问题。
对于液体细胞因子制剂，这种差异恰恰说明为什么需要同时监测理化和生物学指标，而不是使用其中一种结果替代另一种。
十、IL-15制剂II与III的生物学活性曲线有哪些差异
在IL-15生物学活性研究中，制剂II和III均以0.01 mg/mL配制，按照每袋5 mL灌装于20 mL CSS袋，并在2–8℃条件下观察12个月。研究使用CTLL-2细胞开展相应效价测定，数据以每袋MIU表示。
结果显示，制剂II在整个12个月研究中每袋活性保持在约0.45至0.5 MIU。制剂III的效价变化较大，第9个月一度约为0.3 MIU，到第12个月约为0.4 MIU。相比之下，制剂II显示出相对更加平稳的测定表现。
值得注意的是，制剂III在第12个月的效价数值高于第9个月，不应直接推断蛋白质在储存过程中自行恢复了已经发生的全部降解。原稿只给出了相应测定结果和置信区间信息，并未证明这一变化的确切原因。因此，更准确的描述是不同时间点的测定效价存在波动，而制剂II的整体曲线相对平稳。
这也提示生物学测定结果应该结合分析方法的精密度、时间点和置信区间理解，避免仅根据两个时间点之间的高低变化推断确定的化学机制。
十一、为什么还需要把液体制剂与冻干细胞因子进行细胞培养比较
液体制剂在理化及生物学稳定性研究中获得一定结果以后，下一步仍然需要确认它加入实际培养体系后是否具有相应使用价值。特别是对于CAR-T相关制造研究，研究人员不仅关心细胞因子本身的效价，还关心其能否支持细胞培养、CAR表达以及后续细胞亚群和存活状态。
Akron公开资料中进一步使用两名健康供者的冷冻单采血材料，在复苏、分选和活化后比较两类细胞因子加入形式：一类为冻干IL-7、IL-15复溶以后使用，另一类为CSS液体制剂。实验中的IL-7最终浓度为600 IU/mL，IL-15为100 IU/mL，同时加入IL-2至100 IU/mL。配制后的培养基于2–8℃保存12天，再用于相应T细胞培养研究。
研究分析CAR阳性细胞比例、CD4+/CD8+亚群比例，并对收获后经过冻存与再次复苏的细胞测量活率。
结果显示，冻干组CAR阳性细胞比例约47%，液体CSS组约45%；同一供者中，两种剂型对应的CD4+/CD8+亚群比例相近；冻存复苏后CD4+细胞活率约97%至98%，CD8+细胞活率约84%至88%，两组同样具有相近表现。
该结果支持在所研究的两名健康供者及相关培养条件下，两种剂型能够获得相近的所测细胞指标。不过，这是一项具体条件下的初步比较，不代表全部CAR-T产品、所有细胞来源或所有制造设备中的结果都已证明相同。
十二、为什么理化稳定性与细胞功能需要共同评价
液体细胞因子制剂评价的难点之一，在于蛋白质的理化状态和实际细胞功能虽然相互联系，却不一定呈现相同变化。例如，在IL-15制剂II中，12个月时SDS-PAGE纯度约96%，RP-HPLC纯度约65%，但研究仍检测到每袋约0.45至0.5 MIU范围内的生物学活性。
对于IL-7制剂III，9个月时RP-HPLC纯度仍约96%至98%，但浓度已经下降至约3.8 μg/mL，同时每袋生物学效价依然在10 MIU以上。由此可见，一个指标处于较高水平，不意味着其他质量属性均未变化；同样，某个理化指标下降，也不能在没有功能数据的情况下直接推断蛋白质已经完全失活。
因此，液体制剂开发需要在研究之初明确不同检测方法分别回答什么问题，并将蛋白质浓度、纯度、pH、降解相关变化、生物学效价和实际细胞培养结果共同纳入评价。
十三、封闭式细胞治疗制造为什么会改变细胞因子剂型需求
在传统细胞培养中，冻干细胞因子需要复溶、分装和进一步转移。对于开放式研究，这些操作通常能够通过既有实验流程完成；但当细胞治疗制造向自动化、封闭式连接和更小批次独立操作发展时，试剂剂型和交付形式也会影响工艺设计。
液体CSS制剂试图通过小规格、即用型及与封闭系统相适配的包装形式，为细胞因子加入培养体系提供另一种选择。其潜在价值来自减少部分复溶和分装操作，而不是改变IL-7或IL-15的基础生物学功能。
不过，少一步操作并不能自动证明液体剂型整体更优。如果储存后蛋白质浓度和纯度无法满足既定质量目标，或者实际培养结果出现不利变化，那么操作上的便利不足以替代稳定性与功能证据。
因此，选择细胞因子剂型时，研究人员需要将操作流程、实际储存条件、原料质量和细胞功能结果共同评价。
十四、总结
Akron Bio公开的IL-7和IL-15 CSS研究为低浓度液体细胞因子稳定性评价提供了较完整的数据。三种初筛配方显示，缓冲体系与辅料组合能够明显影响IL-15一个月后的可检测浓度和色谱纯度；在长期储存中，IL-15制剂II相对于制剂III表现出更好的浓度和纯度保持能力；IL-7两种制剂则进一步说明，高色谱纯度不一定意味着蛋白浓度没有下降。
研究通过2E8及CTLL-2细胞测定进一步确认了相应生物学活性，并在两名健康供者T细胞中比较液体CSS与冻干剂型，观察到相近的CAR阳性比例、CD4+/CD8+亚群组成及冻存复苏后活率。
这些结果共同说明，液体细胞因子的稳定性不是一个单一的“能存放多久”的问题，而是需要将蛋白质质量、储存环境、实际剂型和生物学功能结合起来判断。对于细胞治疗制造相关研究，只有这些不同层面的数据共同得到充分验证，才能形成具有实际意义的剂型评价依据。
参考文献
[1] Ruiz L, et al. Journal of Pharmacy & Pharmaceutical Sciences. 2005;8:207-216.
[2] Gitlin G, et al. Pharmaceutical Research. 1996;13:762-769.
[3] Torosantucci R, et al. Molecular Pharmaceutics. 2013;10:2311-2322.
关于技术来源
本文基于Akron Bio公开的重组人IL-7、IL-15 CSS液体制剂研究及相关蛋白质稳定性技术资料，曼博生物MineBio整理，用于科研信息分享、液体蛋白配方研究和细胞治疗辅助原料评价参考。文中不同检测方法对应不同质量属性，所有浓度、纯度、效价和T细胞功能结果均需按照原始研究条件理解。正式产品放行、储存有效期和具体生产应用仍应依据相关质量标准及独立验证数据判断。
更多技术内容可参考曼博生物网站：Akron相关技术内容
