微生物鉴定与分类：分离纯化、16S rRNA测序和菌种保藏

每次有人拿着一管浑浊的液体或者一块长满东西的平板问我“这是什么菌”，我通常不急着看显微镜，而是先反问三个问题：样品从哪来、之前做过什么处理、你打算拿它干什么。这三个问题的答案，基本决定了后面该走哪条鉴定路线。生物分类这件事，很多人以为是把名字背熟，其实它更像给一个陌生地址做定位——你得先知道自己在哪一级行政区划上，再一层层往下找。微生物分类比动植物分类更麻烦的地方在于，肉眼能看到的形态特征太少，一株细菌在显微镜下可能就是一根棍或者一个小球，光靠长相根本分不开，必须把形态、生理生化、分子序列几条证据链拼起来用。

这篇内容面向的是需要真正动手做鉴定的人：做环境样品筛选的、做发酵菌种台账的、做食品或水质微生物检验的、以及课题里要报一株菌种的。我不打算复述教科书上的分类表，而是把从样品进实验室到写出一份站得住脚的鉴定结论之间，那些真正会卡住人的环节讲清楚，包括方法为什么这么选、参数怎么定、结果怎么读、哪些地方最容易翻车。

1. 分类体系到底在解决什么问题

1.1 双名法与阶元：它不是背诵题，而是一套坐标系统

分类学的底层逻辑是“用一套层级化的坐标描述亲缘关系”。这套坐标从大到小是域、界、门、纲、目、科、属、种，微生物领域还会在种下面加一个“菌株”的概念。种是分类的基本单元，菌株是同一个种内不同来源分离物的具体个体。这个区分在实际工作里非常关键：你说“我分离到了一株大肠杆菌”，这在分类上只到种；但如果你要发文章或者做专利，必须精确到菌株，因为不同菌株的代谢特性、致病性可能差得很远。

命名用的是双名法，属名在前、种加词在后，正式书写时整体斜体，属名首字母大写。首次在文中出现写全称，之后可以把属名缩写成首字母加一个点。这里有个新手常犯的错：属名缩写只在同文没有其他同首字母属的情况下才安全，如果同时出现了两个首字母相同的属，缩写就会造成歧义，老老实实写全称更稳妥。

还有一个概念必须建立起来：模式菌株。每个正式发表的种名背后都对应一株或多株保藏在公共菌种保藏中心的模式菌株，它是这个种名的“实物锚点”。你做序列比对时，比的应该是模式菌株的序列，而不是数据库里随便一条标注了该种名的序列。很多人比对完发现相似度忽高忽低，问题就出在参比序列的选择上——数据库里有大量序列的种名标注本身就不准。

阶元是人造的分层，自然界里的亲缘关系是连续渐变的。所以你会看到分类地位经常被修订：一个属被拆成几个属、一个种被移到另一个属、亚种被提升为种。这不是分类学家闲着没事干，而是测序数据积累之后，原先基于形态划出来的界限站不住了。做实际工作的人要有这个心理准备：今天报告上写的名字，过两年可能就变了。

1.2 形态、生理生化、分子三条证据链，分辨率完全不同

微生物鉴定发展到现在，大致可以分成三代方法，它们不是替代关系，而是分辨率不同、成本不同、适用场景不同。我把它们的边界整理成一张表，方便你判断手上这株菌该用哪一档。

形态学最大的价值其实是“快”和“便宜”，它能在半小时内告诉你这株菌是革兰氏阳性还是阴性、是杆菌还是球菌、有没有芽孢，这几个信息足以把搜索范围缩小一大半。生理生化是传统鉴定里最扎实的一环，它直接反映菌株的代谢能力，对发酵、环境工程这类看重功能的场景特别有用。分子方法胜在分辨率和可重复性，但它给的是“亲缘关系”，不等于“功能”，一株菌 16S 序列和某致病种 99.9% 相似，不代表它一定致病——致病性往往由质粒或毒力基因决定。

我个人的习惯是三条线都留痕：形态照片留一张、关键生化结果记几个、序列 chromatogram 和比对结果存档。单一证据出结论，后面复核的时候很容易说不清。

2. 分离纯化没做好，后面的鉴定全是白费

2.1 富集培养：给目标菌开一条“专用通道”

环境样品、食品样品、土壤样品直接稀释涂布，最常见的结局是平板被长得快的菌铺满，你想找的那株根本挤不出来。原因很简单：混合样品里目标菌的丰度可能只有千分之一甚至更低，而速生菌在营养充足的平板上几小时就能形成肉眼可见的菌落。

富集的核心思路是“用选择性压力把目标菌的比例拉上来”。常用的压力有几种：温度、pH、唯一碳氮源、抑制剂。分离芽孢杆菌时，把样品在 80 摄氏度水浴里处理 10 分钟，营养细胞被杀死，芽孢存活，再涂布就相当于做了一次大规模筛除。分离放线菌常用高氏一号培养基，里面加 50 mg/L 左右的重铬酸钾抑制细菌和部分真菌，同时把 pH 调到 7.2 到 7.4，因为放线菌比多数细菌更耐碱一点。分离真菌用 PDA，加链霉素或者青霉素到 50 微克每毫升，抑制细菌。

注意：抗生素类抑制剂必须用 0.22 微米滤膜过滤除菌后再加入已经灭菌并降温到 50 摄氏度左右的培养基，直接高温灭菌会让抗生素失活。

富集不是万能的。有些菌在人工培养基上就是不长，这叫“活的但不可培养”，环境微生物里比例很高。遇到这种情况，盲目加大涂布量没有意义，得考虑换低营养培养基、延长培养时间到两周以上、或者用共培养的方式。

稀释梯度也要讲究。十倍系列稀释，从 10 的负一次方做到负七次方，每个梯度涂 0.1 毫升，选菌落数在 30 到 300 之间的平板做后续挑取。低于 30 个统计意义不够，高于 300 个菌落互相挤压，挑单菌落容易混。

2.2 划线纯化：单菌落看起来一样，不代表就是纯培养

拿到初步分离物之后，必须做纯化。三区划线是最经典的做法：接种环灼烧灭菌、冷却、蘸取菌液，在第一区来回划线，灼烧接种环，从第一区边缘穿过划第二区，再灼烧，从第二区穿过划第三区。每一次灼烧都是为了把接种环上的菌量降下来，最后才有机会得到由单个细胞繁殖来的孤立菌落。

这里有个细节很多人忽略：接种环灼烧后一定要等它冷却。没冷却的接种环碰到菌液会溅射，形成气溶胶，既污染环境也污染平板。判断冷却的方法很简单，把环靠近培养基边缘，如果听到轻微的滋滋声或者看到琼脂被烫化，就是还太热。

单菌落长出来之后，别急着下结论。同一个平板上挑三个形态一致的孤立菌落，分别转接到新的平板，同时做革兰氏染色镜检。如果三个转接平板上长出来的菌落形态一致、镜检细胞形态和染色反应一致，才能初步认为是纯培养。严格一点的做法是纯化两轮，第一轮挑单菌落，第二轮再从第一轮的单菌落里挑一次。

挑菌的时机也有讲究。菌落太小时细胞处于延迟期，转接后长得慢；菌落长老了，细胞形态会变形，革兰氏阳性菌容易脱色变成假阴性。一般在菌落直径 1 到 2 毫米、边缘还比较整齐的时候挑最合适。

3. 从染色到测序：鉴定流程的递进逻辑

3.1 革兰氏染色能给出的信息，比你以为的多

革兰氏染色的四个步骤是结晶紫初染、碘液媒染、乙醇脱色、番红复染。原理是革兰氏阳性菌细胞壁肽聚糖层厚，乙醇脱水后孔径缩小，结晶紫-碘复合物被锁在细胞里；阴性菌肽聚糖层薄、外膜含脂质，乙醇把脂质溶掉，复合物被洗出来，最后被番红染成红色。

操作上最容易出问题的就是脱色这一步。95% 乙醇脱色时间一般控制在 10 到 20 秒，以流下的液体刚好不再带紫色为准。脱色不足，阴性菌也会留紫色，报成阳性；脱色过度，阳性菌也会变红，报成阴性。菌龄也是变量，培养超过 48 小时的阳性菌，细胞壁老化，很容易脱色过度。所以染色用的菌一定要用对数后期的新鲜培养物。

除了革兰氏反应，镜检还能看很多东西：细胞是球状、杆状还是弯杆状，是单个分散还是成链、成簇、成四联，有没有芽孢以及芽孢在细胞里的位置是中央、次端还是端生，有没有荚膜。这些信息组合起来，能把范围缩得很小。比如革兰氏阳性、产端生芽孢、细胞呈杆状，基本就指向芽孢杆菌类群的方向了。

运动性可以用半固体穿刺来判断，琼脂浓度降到 0.3% 到 0.5%，用接种针从培养基中心垂直刺入到底部再原路拔出，培养后看菌是否从穿刺线向四周扩散成雾状。扩散的是有运动能力的，只沿穿刺线生长的是不动的。这个方法比鞭毛染色稳定得多，鞭毛染色对菌龄和玻片清洁度要求很高，新手很难做漂亮。

3.2 生理生化鉴定：商品化鉴定条的逻辑与它的天花板

生化鉴定的本质是“用一组预设的化学反应给菌株打一个指纹”。氧化酶试验测细胞色素氧化酶，用四甲基对苯二胺浸过的滤纸接触菌落，阳性会在 10 到 30 秒内变深蓝紫色。触酶试验滴 3% 过氧化氢，冒气泡为阳性。糖发酵用含指示剂的糖管，看产酸产气。IMViC 这一组——吲哚、甲基红、VP、柠檬酸盐利用——在肠杆菌类群的区分里非常经典。

商品化的生化鉴定条把二十几个反应集成在一排小孔里，培养后读颜色变化，阳性和阴性编成数字，加总得到一个编码，再去查编码表或者用软件比对。这套东西的好处是标准化、可重复，缺点是它的数据库主要覆盖临床和环境常见菌，做环境样品分离出来的少见菌，经常查不到或者给出一个很勉强的结果。

我用生化鉴定条的经验是：接种浓度一定要按说明书来，浊度调得太浓，底物被快速耗尽，可能出现假阴性；调得太稀，反应弱，读不出来。培养时间也不能随意缩短，有些反应就是慢，提前读等于白做。还有一点，生化结果和分子结果打架的时候，不要急着否定分子结果，先回头看病株是不是纯、培养条件是不是标准、鉴定条的批次有没有问题。

3.3 16S rRNA 测序：为什么它能成为细菌鉴定的主力

16S rRNA 基因被选作细菌鉴定的通用标记，原因有几个：所有细菌都有这个基因，功能保守所以不会横向漂移；全长大约 1500 bp，包含保守区和可变区交替排列的结构，保守区用来设计通用引物，可变区提供分辨信息；长度适中，一代测序一次就能读完；数据库积累量大。

常用引物有两套思路。做全长扩增用 27F 和 1492R，产物接近 1500 bp，信息量最全。做高通量测序或者只想要一个快速结果，用 V3-V4 区，引物是 338F 和 806R，产物 450 bp 左右。全长序列在区分近缘种时更有优势，V3-V4 片段短，某些属里区分度会下降。

菌落 PCR 是最省事的做法：用灭菌枪头挑半个单菌落，直接加到 PCR 体系里。反应体系可以这样配：10 微升 2 倍预混液、上下游引物各 0.4 微升（10 微摩尔每升）、挑菌的菌液 1 微升、补无菌水到 20 微升。程序是 95 摄氏度预变性 5 分钟，然后 95 摄氏度 30 秒、55 摄氏度 30 秒、72 摄氏度 90 秒，跑 30 个循环，最后 72 摄氏度延伸 10 分钟。

菌落 PCR 最常失败的原因是模板加太多。整团菌落带进去的培养基成分、细胞裂解物会抑制聚合酶，表现就是条带很弱或者干脆没有。挑菌的时候少挑一点，或者在体系里把菌液稀释十倍再用。扩增产物跑 1% 琼脂糖凝胶，电压 100 到 120 伏，20 分钟左右看结果，目标条带清晰单一再送测序。

真菌的标记不一样，常用 ITS 区，引物是 ITS1F 和 ITS4。酵母有时用 26S rDNA 的 D1/D2 区。放线菌虽然也能用 16S，但链霉菌属内部很多种的 16S 序列几乎一样，光靠 16S 分不开，需要补 gyrB、rpoB 这类管家基因或者直接上全基因组。

3.4 相似度阈值：98.7% 不是法律条文，是经验边界

序列拿到手，去掉两端低质量区和引物，做拼接，然后拿去公共序列数据库比对。行业里常引用的经验阈值是这样的：和模式菌株的 16S 相似度大于等于 98.7%，可以认为属于同一个种；在 95% 到 98.7% 之间，通常属于同一个属的不同种；低于 95%，有可能是新属。这套数字来自大规模数据统计，是概率意义上的边界，不是硬性规定。

实际用的时候要注意两件事。第一，不同属的种间差异幅度差别很大，有些属 16S 相似度 99.5% 就已经是不同种了，有些属 98% 还属于同一个种。第二，16S 分辨率在几个大属里明显不够，芽孢杆菌属、假单胞菌属、肠杆菌属、链霉菌属都是重灾区。这时候需要补测其他基因，或者用全基因组算平均核苷酸一致性，种级阈值一般取 95% 到 96%，数字杂交的阈值是 70%。

如果确实怀疑是新种，那就不是多测几个基因能解决的事了，需要走多相分类的完整流程：形态、生理生化、化学分类（细胞壁氨基酸、脂肪酸、醌类）、分子系统发育、基因组比较，还要把模式菌株保藏到两个公共菌种保藏中心，并在正式发表时提供保藏编号。这条路周期长、投入大，不是随便写个报告就能叫新种的。

4. 序列比对里最容易翻车的几个环节

4.1 嵌合体与低质量序列：先怀疑数据，再怀疑结论

PCR 扩增过程中，如果模板里有两条不同的序列，聚合酶在延伸中途可能发生模板切换，产生一条前半段来自 A、后半段来自 B 的嵌合序列。这种序列拿去比对，会出现首尾分别匹配不同属的诡异结果。判断方法不复杂：把序列分段比对，看前 500 bp 和后 500 bp 的最高匹配是不是指向同一个分类单元；或者用专门的嵌合体检测工具跑一遍。

低质量序列的表现是末端大量 N、峰图重叠、信号突然衰减。这种序列不要硬着头皮往下分析，截到高质量区段再用，或者重新扩增测序。我见过不少“鉴定失败”的案例，回头看原始峰图，根本就是测序反应本身没做好。

4.2 数据库版本与命名变更：同一个序列可能有三个名字

公共序列数据库是动态更新的，同一个登录号在不同时间点查询，注释的分类名可能已经变了。更麻烦的是，数据库里有相当比例的序列本身标注就有误，尤其是早期提交的、只做了部分测序的条目。用这样的序列做参比，得出的结论自然不可靠。

稳妥的做法是只拿模式菌株的序列做参比，并且记录你使用的数据库版本和查询日期。比对结果里不只要看相似度百分比，还要看比对覆盖度——一条只有 400 bp 参与比对、相似度 100% 的结果，参考价值远低于 1400 bp 参与比对、相似度 99% 的结果。覆盖度低说明你的序列和参比序列只有局部同源，可能是保守区碰巧撞上了。

命名变更也要留意。一个属被拆分之后，原来的种名会变成“某属某某菌”的新组合，旧名字在文献里还能搜到，但报告里应该用当前有效的名称，并在必要时括注曾用名。

4.3 污染：从试剂到气溶胶，防不胜防

分子鉴定里最隐蔽的问题是污染。常见来源有三类：试剂本底（核酸提取柱、聚合酶、水里的微量核酸）、环境气溶胶（前一个样品扩增产物飘过来）、操作交叉污染（同一支移液器吸头没换）。

防的办法很朴素：每一批 PCR 都设阴性对照，模板用无菌水代替，跑完胶看阴性对照有没有条带；提取区和扩增区分开，扩增产物绝不带回提取区；移液器定期清洁，吸头一用一换。如果阴性对照出条带，这批结果全部作废，先排查试剂批次。

还有一个现象值得警惕：同一批不同样品里，测出来好几条一模一样的罕见序列。这大概率不是生物学真实，而是污染或者标签串样。遇到这种情况，把样品重新提取、重新扩增一次，同时把样品处理顺序打乱，看看结果是否还一致。

4.4 系统发育树不是装饰，但也不能当判决书

构建系统发育树是为了看你的序列和一组参比序列之间的相对位置关系，而不是简单地看相似度排序。选参比序列的原则是：包含同属的模式菌株、包含近缘属的代表、加一个外群。序列先用多序列比对工具对齐，比对完要人工检查并修剪两端不保守的区域，否则树会被末端乱序带偏。

建树方法常用邻接法和最大似然法，前者快，后者更稳健。不管用哪种，都要做 1000 次自举检验，看分支上的支持率。支持率低于 70% 的节点基本可以认为关系不明确，不要拿它说事。树形结构呈现出来的是一个拓扑关系，它告诉你“这几条序列聚在一支”，不直接等于“这就是某个种”。最终的鉴定结论仍然要结合相似度、覆盖度、形态和生化结果综合判断。

5. 鉴定结论怎么写、菌种怎么存

5.1 报告措辞：把“相似”和“就是”分开

一份能经得起复核的鉴定报告，至少要包含这些内容：样品编号和来源、分离培养基和培养条件、所用鉴定方法及引物、序列长度和访问号、参比序列的登录号和分类名、相似度和覆盖度、系统发育分析结果、以及结论。

结论部分的措辞是最容易出问题的地方。相似度 99.2% 只能说明“与某模式菌株高度相似，最相近的分类单元为某某菌”，不能直接写成“鉴定为某某菌”。如果相似度落在种和属的边界区间，写明“提示为某属的潜在新种，需进一步分析”。这种表述看起来啰嗦，但它准确反映了数据的支持力度。把不确定的东西写成确定，后面一旦被复核或者被追溯，麻烦会更大。

5.2 菌种保藏：别让一株好菌死在冰箱里

鉴定做完，菌株要存下来。短期保存用斜面，4 摄氏度可以放一到三个月，适合频繁使用的工位菌株。中长期用甘油管，终浓度 20% 左右，零下 80 摄氏度保存。长期保存用冷冻干燥，菌种保藏中心一般用这个方法，存活期可以按年算。

操作细节上，甘油管保存要现配现用，配好的甘油先灭菌再和菌液等体积混合，混匀后分装到冻存管，每管 1 毫升，直接放零下 80 摄氏度。不要反复冻融，取用的时候拿一管出来快速解冻，用不完的不要放回去。复活的时候，从甘油管蘸取少量菌液划到平板上，不要整管倒进液体培养基里，那样既浪费又容易污染。

还有一件事容易被忽略：菌株台账里的名称要和当时的鉴定结果绑定，并且记录数据库版本和鉴定日期。分类名会变，今天叫这个名字，明年可能就改了，有记录才能追得回去。

最后分享一个我自己的习惯：凡是走到序列这一步的菌株，我都会同时留一份菌液、一份基因组 DNA、一份峰图原始文件和一份比对截图。这套东西放在一起，三年后有人问起这株菌是怎么定的，我能当场把证据链摊开。分类这件事，结论可以商量，证据不能含糊。