 简要实验 Protocol)
一、实验耗材与试剂配制
1. 实验材料
SPF 级小鼠（推荐新生 1–3 日乳鼠，细胞活力、纯度最优；成年小鼠亦可，细胞增殖偏弱）、超净工作台、CO₂培养箱、体视显微镜、恒温水浴锅、低温离心机、70 μm 细胞筛、培养皿、离心管、显微解剖器械套装
2. 试剂配方
- 预冷无菌 PBS（含双抗）PBS 粉剂配制，添加 100 U/mL 青霉素 + 100 μg/mL 链霉素，4℃预冷备用
- 混合消化液0.25% 胰蛋白酶 + 0.1% Ⅱ 型胶原酶，无血清 DMEM 稀释，现配现用
- 完全培养基DMEM/F12 基础培养基 + 10% 胎牛血清 (FBS) + 1% 青链霉素双抗
- 裂解试剂：Trizol（RNA 提取）、RIPA 裂解液 + 蛋白酶抑制剂（蛋白提取）
二、组织取材步骤（全程冰上低温操作，抑制细胞凋亡）
- 乳鼠脱颈处死，全身浸泡 75% 医用乙醇消毒 15 s，移入超净台；
- 俯卧固定小鼠，沿脊柱中线剪开背部皮肤与肌肉，暴露脊柱；
- 体视显微镜下剪开椎管，逐节取出两侧背根神经节（DRG）；
- 收集所有 DRG 置于预冷含双抗 PBS 中，精细剔除外周神经纤维、结缔组织包膜、血管杂质；
- PBS 漂洗 2 次，彻底去除血液残留；无菌眼科剪将 DRG 剪碎至 1 mm³ 细小组织团块。
三、组织酶解消化
- 将剪碎 DRG 组织移入 15 mL 离心管，加入 3–5 mL 混合消化液浸没组织；
- 置于 37℃恒温水浴锅消化 35 min，每 10 min 轻柔吹打 3–5 次，打散组织团；
- 消化终点判断：组织呈絮状松散状态，即刻加入等体积完全培养基终止胰酶消化；
- 细胞悬液经 70 μm 无菌细胞筛过滤，去除未消化组织残渣。
四、离心富集与差速贴壁纯化（去除神经元核心步骤）
- 过滤后细胞悬液：1000 rpm，室温离心 5 min，小心弃去上清；
- 沉淀用 2 mL 完全培养基轻柔重悬，充分吹散细胞团；
- 将细胞悬液接种至细胞培养皿，放入 37℃、5% CO₂培养箱静置45 min； 原理：卫星胶质细胞贴壁速度快；大体积神经元悬浮于上清中，几乎不贴壁
- 缓慢吸取上层含神经元的悬浮上清丢弃，沿皿壁缓慢加入新鲜完全培养基；
- 若需极高纯度：可重复一次差速贴壁流程，大幅降低神经元污染率。
五、细胞常规培养
- 培养环境：37 ℃、5% CO₂、饱和湿度恒温培养箱；
- 接种后 24 h 首次全量换液，清除细胞碎片、凋亡杂质；
- 后续每 2~3 天更换一次完全培养基；
- 细胞生长状态：3~4 天汇合度可达 80%~85%；
- 图.武汉云克隆小鼠卫星胶质细胞(SGC)原代细胞白光形态图（x100）
使用建议：卫星胶质细胞增殖能力有限，优先选用 P1、P2 代细胞开展功能实验，传代过多会出现细胞老化、表型丢失。
六、细胞传代操作
- 弃旧培养基，预冷 PBS 漂洗细胞 1 次；
- 加入 0.25% 胰蛋白酶室温消化 2~3 min，显微镜下观察细胞皱缩变圆；
- 立刻加入完全培养基终止消化，轻柔吹打皿底制成单细胞悬液；
- 离心、重悬后按 1:2 比例分皿接种培养。
七、细胞纯度鉴定（免疫荧光法）
标志物判定： 卫星胶质细胞阳性标记：GFAP
图.武汉云克隆小鼠卫星胶质细胞(SGC)原代细胞免疫荧光鉴定图（GFAP抗体，x200）
阴性对照：NeuN（神经元标志物，用于排查神经元污染）
合格标准：GFAP 阳性细胞占比≥90%
八、关键注意事项 & 常见问题规避
- 取材全程低温：DRG 离体后极易受损，冰上操作缩短时长；
- 消化时间不可过长：过度消化会破坏细胞膜，大幅降低细胞活率；
- 差速贴壁时间严格把控：过短纯度不足，过长胶质细胞损耗过多；
- 成年小鼠 SGC 活性偏低，衰老更快，药物、机制实验首选新生乳鼠取材。
