文献方法分享--组织图谱揭示了免疫组织模体的特化及其被肿瘤所劫持的过程

作者，Evil Genius

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大家看文献，一方面看文献的研究内容，另一方面也要看其中的逻辑。

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知识积累

生物系统的示意图——即对其组成部分、组合方式及功能的呈现——有助于理解其在病理发生或进化过程中的本质组织与变化。

组织示意图（TS）：解析组织架构单元及其在生理与病理中的组装机制

核心概念

组织示意图（TS）是一个结合概念与算法的框架，用于从高参数成像数据中定义和量化组织的架构单元及其组装方式。TS包含三个组成部分：

细胞邻域（CNs）：由特定细胞类型局部组成特征定义的区域。

空间环境（SCs）：共定位的CNs形成的不同微环境，代表局部过程可能发生相互作用的组织区域。

基序（Motifs）及其组装规则（ARs）：具有特定SCs关系的CN区域按层级形成的集合，以及支配其形成的规则。

方法开发与验证

研究以人类淋巴组织（HLT）（包括扁桃体、淋巴结和脾脏）为理想模型系统进行开发和验证，因其具有共同目的但功能特化。使用CODEX成像数据集，研究：

识别了HLT中的CNs集合，并验证其符合TS生物学模型。

开发了算法来识别SCs，并创建了“CN组合图（CNM）”进行可视化。CNM揭示了与已知免疫架构功能一致的结构，并提示可通过细胞类型的表型变化来识别SCs中CNs局部过程的相互作用。

识别了HLT中的基序及其在各组织类型中的组装规则，并利用这些规则对齐了不同淋巴组织的架构，量化了其复杂性。

分析揭示了一个核心淋巴基序，以及各组织类型对其的特化。

发现扁桃体架构最复杂，淋巴结次之，脾脏最简单；扁桃体与淋巴结的组装相似性高于它们各自与脾脏的相似性。

在肿瘤微环境中的应用

为了探究SCs和基序是否具有功能意义，研究将TS分析方法应用于人类结直肠癌（CRC）的免疫-肿瘤微环境（iTME）数据集。该数据集包含两类患者：具有三级淋巴结构（TLS）且预后较好的克罗恩样反应（CLR）组，和无TLS、预后较差的弥漫性炎性浸润（DII）组。

SCs图谱与功能推断：通过绘制SCs并分析其与关键免疫细胞亚群功能标志物表达变化的关联，构建了CRC iTME的CNM，揭示了CNs及其局部相互作用的潜在功能角色（例如，TLS可能参与抗原依赖性、辅助T细胞介导的B细胞增殖）。

高阶基序与患者预后：通过量化“高阶”基序（即主动抵抗熵增的生物程序组装而成的基序），在高风险DII患者组中发现了一个由3个CNs（T细胞富集、巨噬细胞富集、脉管系统邻域）连续组装而成的高阶组织基序，其中插入了肿瘤CN。肿瘤插入该基序与高风险组患者生存期缩短显著相关，而其次级基序则无此关联。这证实了TS方法能够从模块化组装中识别和解剖涌现的组织功能。

总结一下

研究提出的TS框架，通过将组织解构为细胞邻域、空间环境和基序等层级化模块，并提供量化其组装的算法，为理解组织在生理状态下的功能构建及在病理状态（如肿瘤免疫微环境）下的功能紊乱提供了新工具。在HLT和CRC中的应用表明，TS能够：

揭示跨组织类型保守的核心架构单元及其特化。

量化并比较不同组织的架构复杂性。

识别与疾病预后相关的特定高阶组装模式，从而为抗肿瘤免疫等过程提供潜在的机制性见解。

TS框架强调了从定量探索组织组成性组装的角度，获取对组织功能与功能障碍的基础和转化认知的实用性。

结果1、细胞邻域（CNs）作为组织示意图的基本构建单元

组织示意图（TS）框架如何将CNs作为基础组件，来解析和量化组织架构与功能。

核心论点：

TS是一种计算描述，旨在阐明组织如何从其组件构建而成。其核心思想是：

组件定义：组织由具有特定局部分子过程的区域组成，这些过程能产生、传递和处理生物信号。

层级组装：通过空间接触，简单组件（如CNs）组装成更复杂的组件。

功能涌现：复杂组件通过其子组件间的相互作用（信号传导与局部过程耦合）实现高级生物学功能。

CNs作为局部过程的近似：

在生物模型中，局部过程主要由细胞和细胞间相互作用介导。因此，研究将细胞邻域（CNs）——定义为具有特征性局部细胞类型组成的区域——作为这些“具有局部过程的区域”的近似和计算单元。CNs是构建TS的原始组件。

从CNs到组织示意图的构建：

识别空间环境（SCs）：CNs之间发生局部空间接触的区域称为SCs。这些是不同CN的特征性局部过程可能发生相互作用的位点。SCs的集合通过CN组合图（CNM）进行描述。

定义基序与组装规则：具有特定SCs关系的、相互连接的CN区域集合称为一个“组装”。在组织中反复出现的特定组装模式称为“基序”。支配这些基序如何形成的规律称为“组装规则”。

TS的完整描述：一个TS通过识别CNs、它们形成的SCs以及支配其组装的规则，来描述组织的构建方式。

在人类淋巴组织（HLT）中的具体实施：

数据：使用CODEX技术获取的两个扁桃体、一个淋巴结和一个脾脏的46参数图像。

细胞与CN识别：通过单细胞分割和聚类识别出25种细胞类型。通过分析每个细胞及其19个最近邻细胞的细胞类型组成窗口，聚类并验证后，最终确定了HLT中的11个CNs。

CNs的特征：

其中7个CNs（如富含粒细胞的cnGr、富含B/T细胞的cnBT、富含T细胞的cnT、富含血管的cnV等）在所有四种淋巴组织中都存在。

另外4个CNs具有组织特异性（如仅存在于扁桃体的上皮相关cnEp，仅存在于淋巴结的髓窦cnMS，仅存在于脾脏的巨噬细胞富集cnMF，以及不存在于所成像脾脏样本中的生发中心暗区cnDZ）。

验证：CNs的可视化显示，它们能够捕捉并代表经典血液病理学中识别的组织区域（如B细胞滤泡、生发中心、T细胞区），证明了其作为TS构建基础的适用性。

总结：

CNs作为表征组织局部功能单元的有效近似，是构建TS、进而理解CNs如何通过特定规则组装成复杂结构（基序）并最终实现组织功能的起点和基石。接下来的问题将是：这些CNs如何组装以产生HLT的复杂功能？

结果2、空间环境（SCs）作为局部组织过程可能的相互作用位点

SCs是不同细胞邻域（CNs）紧密接触的组织区域，被认为是各CN特征性局部过程通过局部分子反应发生相互作用的位点。这些相互作用可能体现在该区域特有的生物学过程中。SCs在组织示意图中充当“中继站”，将各个组件连接起来。

SCs的识别与表征方法：

研究提出，一个细胞的最近邻细胞（根据其CN归属）的组成反映了该细胞所处的SC。基于此，开发了一套系统性识别SCs的方法：

定义分析窗口：以每个索引细胞为中心，提取其100个最近邻空间细胞（约5个细胞半径）作为一个窗口，该尺度被认为足以在CNs间传递具有生物学意义的信号。

分配最小CN组合：为每个细胞分配一个最小的CN组合，使其窗口中90%的细胞属于这些CN。这对应于用最少的CN来解释窗口中主要的信号来源。

可视化与量化：通过CN组合图（CNM） 来总结和可视化SCs。CNM中：

每个节点代表一个特定的SCs（由其标签所示的CN共定位定义）。

节点大小反映被分配到该SCs的细胞数量。

节点间的边表示子节点CN组合由父节点CN组合添加一个CN而形成。

在人类淋巴组织（HLT）中的应用与发现：

研究以HLT中的两个关键区域为例深入分析了SCs：

滤泡区（B细胞滤泡）：主要涉及cnB、cnDZ、cnLZ。分析发现其SCs包括三个“区室化”区域（Comp. LZ, DZ, B）和两个“界面”区域（LZ-DZ界面、LZ-B界面）。这种结构与生发中心抗体亲和力成熟的经典模型一致：暗区（DZ）与明区（LZ）的分离，以及细胞在两者间的循环。

T细胞区：主要涉及cnBT、cnT、cnV。其CNM显示出不同的结构：cnT有大的区室化区域，而cnBT和cnV的区室化区域很小；三者存在广泛的共定位和混合（BT-T-V混合）。这反映了T细胞区信号生成和传播机制的扩散性。

CNM揭示的生物学洞见：

对整个HLT样本构建的全局CNM的分析，揭示了CNs之间相互作用模式的重要信息：

功能耦合的CNs：某些CNs（如cnLZ与cnDZ，cnGr与cnMF）在CNM中紧密关联且与其他CNs连接较少，提示它们主要通过彼此间的信号传导实现功能。

信号枢纽CNs：某些CNs（如cnV、cnBT）与许多其他CNs形成SCs，表明其作为信号输入/输出枢纽的重要性（如血管cnV负责物质输送和细胞运输）。

区室化程度的意义：某些CNs（如cnT、cnB）拥有大的区室化区域，可能意味着其功能需要局部过程与外部信号隔离；而另一些CNs（如cnPl、cnBT）虽然区室化区域小但广泛存在，表明其功能不依赖于严格隔离。

CNs的共现规律：例如，cnT和cnB经常共现，但缺少cnBT的SCs丰度较低，这提示B细胞（cnBT）可能在cnT与其他CNs的信号交互中扮演转化或招募角色。

发现意外结构与功能区域：CNM揭示了意想不到的CN组合，例如涉及cnBT、cnPl与滤泡CNs（cnB、cnDZ、cnLZ）的组合。通过表型标记物（CD38、PD-1）染色验证，这些SCs对应于生发中心外层——一个仅存在于部分滤泡、富含浆细胞前体的特定微环境。这证明了CNM能够识别出传统可视化中易被忽略的、动态或异质性的功能位点。

结果3、细胞邻域实例的模块化组装在不同人类淋巴组织类型中存在差异

研究假设，发生在空间环境（SCs）中的CN局部过程间的相互作用，可能通过信号转导和接力传播，促进复杂组织行为的产生。一组具有特定SCs关系的相互连接的CN区域（称为一个“组装”）能够通过耦合其中各CN的过程来产生独特的生物信号。如果这一假设成立，那么特定组织类型的CNs组装方式应存在内在规律，这些规律反映了简单过程如何被串联以产生复杂信号。

方法：描述CN实例的组装

定义“实例”：组织中每个连续的CN组分称为该CN的一个“实例”（即该CN在空间上独立存在的区域）。

构建组织图：以CN实例为节点，以实例间的空间邻接关系为边，构建组织图。

识别“基序”与“组装规则”：

基序：图中反复出现的特定子图模式，对应于CN实例的特定组合与空间关系。

组装规则：支配CN实例如何组装成基序的规则。基本组装规则是一组无法从更简单规则推导出的、能生成全部规则的核心子集，它们代表了组织架构中涌现的约束条件。

发现：量化与比较不同淋巴组织的组装规则

将方法应用于人类淋巴组织（HLT）数据集，量化并比较了扁桃体、淋巴结和脾脏的组装规则：

架构复杂性：脾脏涉及两个以上CNs的基本规则数量最少，而两个扁桃体则拥有更多此类规则。这表明脾脏的架构比扁桃体更简单，可能参与的、通过架构程序重利用而产生的多样化免疫输出也更少。

组织间相似性：扁桃体与淋巴结共享76条链状四CN基序相关的基本规则，远多于它们各自与脾脏共享的数量。这从计算上量化并证实了扁桃体与淋巴结在架构上比它们各自与脾脏更相似的经典认知。

发现：保守的核心淋巴组装规则

在所有三种淋巴组织中都保守的五条基本规则构成了核心淋巴组装规则：

cnT / (cnBT-cnT)

cnV / (cnV-cnPl)

cnLZ / (cnB-cnLZ)

cnB / (cnB-cnPl)

cnB / (cnB-cnBT)

这些规则共同蕴含：cnLZ总是被组装进更大的基序 (cnLZ-cnB-(cnPl, cnBT)) 中。这表明cnLZ在淋巴组织中的作用可能依赖于其信号与cnB-(cnBT, cnPl)基序处理信号之间的相互作用。

发现：组织特异性的组装规则与功能适应

脾脏：规则表明，所有cnLZ实例都仅被cnB包围。因此，cnLZ与其他CNs间的所有信号传播都必须通过cnB，并可能被其局部过程转化。

淋巴结：规则揭示了两种cnB实例：一种位于副皮质区与cnLZ相邻（套区），另一种位于髓窦不与cnLZ相邻。但两者都与cnBT和cnPl相邻。这表明 cnB-(cnBT, cnPl)是一个模块化组件，在副皮质和髓窦中扮演相似角色，但只有副皮质中的该组件与cnLZ组装以实现更高级功能。

扁桃体：规则展示了一个涉及cnGr、cnB将cnLZ/cnDZ与上皮（cnEp）分隔开的滤泡结构组装路径。这提示cnB在扁桃体中充当了从上皮粘膜到滤泡套区的物理桥梁，可能富集记忆B细胞以增强复杂组装中不同组件间的信号传播。

结果4、结直肠癌免疫-肿瘤微环境中细胞邻域局部过程的“布线图”与相互作用

一个已发表的CODEX数据集，包含两类CRC患者：

克罗恩样反应（CLR）组：存在三级淋巴结构（TLS），患者生存预后较好。

弥漫性炎性浸润（DII）组：缺乏TLS，患者生存预后较差。

研究目标：利用TS方法解析iTME的架构，并探究淋巴结构在新生外周部位（肿瘤）中如何部署以对抗肿瘤。

方法步骤与发现：

识别差异富集的SCs：在已定义的9个CNs基础上，识别了55个在患者间保守的SCs。其中4个SCs的丰度在两组患者间存在显著差异：

CLR组富集：SC(5) [滤泡区室化区域]、SC(1,5) [T细胞富集区-滤泡界面]、SC(1,4,5) [T细胞-巨噬细胞-滤泡三向组合]。这与CLR组存在功能性TLS一致。

DII组富集：SC(1,2,4,6) [T细胞-肿瘤核心-巨噬细胞-肿瘤边界四向组合]。这提示在缺乏TLS时，肿瘤核心（cn2）与边界（cn6）等CNs的直接空间接触可能介导了特定相互作用。

推断SCs中的功能信号：通过比较各SCs中关键免疫细胞亚群（CD4+ T、CD8+ T、B细胞、巨噬细胞）功能标志物（PD-1、Ki67、VISTA）的表达水平与背景组织的差异，来推断由CN局部过程相互作用产生的信号。

滤泡（TLS）的局部过程：在滤泡区室化区域SC(5)中，观察到B细胞和DC增殖增加、DC上VISTA表达降低，以及CD4+ T细胞上PD-1表达增加（与T滤泡辅助细胞存在一致）。这表明iTME中的TLS重现了健康淋巴器官的抗原驱动激活过程。滤泡通常被cn1（T细胞富集区）包围，且SC(1)中B细胞PD-1表达增加、增殖减少，类似于淋巴器官中B细胞在形成滤泡前在T细胞区被激活的“布线”模式。

肿瘤核心与边界的相互作用：肿瘤核心区室化区域SC(2)也显示出免疫细胞激活迹象（如CD8+ T细胞增殖和PD-1表达增加）。关键发现：巨噬细胞增殖的增加仅出现在同时包含cn2（肿瘤核心）和cn6（肿瘤边界）的SCs中（如SC(2,6)、SC(1,2,4,6)等），而在仅含cn6或仅含cn2的SCs中未出现。这表明cn2和cn6的局部过程相互作用，产生了促进巨噬细胞增殖的信号。

巨噬细胞富集区的调控作用：cn4（巨噬细胞富集）的区室化区域SC(4)是唯一显示巨噬细胞VISTA表达降低的SC，提示其局部过程可能调控巨噬细胞表型。此外，SCs如SC(1,3,4)中观察到广泛的免疫细胞增殖抑制和PD-1表达降低，同时DC上抑制性标志物VISTA表达增加，这表明cn1、cn3、cn4的局部过程相互作用可能产生了通过DC介导的T细胞抑制信号。

粒细胞富集区的潜在保护作用：先前研究显示DII患者中cn9（粒细胞富集）内CD4+ PD-1+ T细胞频率增加与生存改善相关。本分析发现，在涉及肿瘤的SCs中DC的PD-1表达增加，而在涉及cn9的SCs中其表达降低。这提示cn9与cn2（肿瘤）的局部过程可能对DC表型具有相反的调控作用，从而影响抗肿瘤免疫应答。

总结：

通过对CRC iTME的TS分析，特别是绘制CNM并叠加关键免疫细胞的功能状态信息，成功构建了iTME局部过程的 “相互作用布线图”。该图谱揭示了：

功能性TLS在肿瘤中重现了类似健康淋巴组织的激活模块。

肿瘤核心与边界之间特定的相互作用可驱动巨噬细胞增殖。

不同的CN组合可以产生抑制性或激活性的免疫微环境。

特定CN（如粒细胞富集区）可能具有对抗肿瘤相关免疫抑制的潜在保护作用。

TS框架能够精细解析疾病组织（如肿瘤微环境）中复杂的细胞空间组织与功能状态之间的关联

结果5、高阶组织组装调控结直肠癌的抗肿瘤免疫

核心发现：iTME的组装有序性及其临床意义

对患者组织图的分析发现，与拥有三级淋巴结构（TLS）且预后较好的CLR组相比，缺乏TLS、预后较差的DII组患者的组织图更为碎片化（CN实例更多，平均连接度更低）。这引出了一个关键问题：DII组的碎片化是单纯的“无序”状态，还是一种有利于肿瘤的“另类有序”？

方法：识别“高阶基序”

引入“高阶基序”的概念，即那些观测频率显著偏离基于最大熵零模型预期的基序。这种偏离表明组织可能正在主动消耗能量来组装这些结构，以对抗熵增。因此，高阶基序很可能在组织功能中扮演其子组件无法实现的、重要的涌现性角色。

研究设定了两个层次的零模型进行比较：

Level-0：仅固定每个CN实例的数量。

Level-1：进一步固定所有二链基序（两个CN的连接）的数量。

关键发现与结论

DII组并非简单无序，而是存在不同的组装秩序：虽然两组患者的高阶二链基序数量相似，但具体内容不同。例如，涉及粒细胞富集区（cn9）的高阶二链仅在DII组出现，这与先前发现cn9的功能状态与DII患者生存改善相关一致，提示其组装是主动指定的。

关键高阶三角形基序与免疫表型关联：

CLR组：三角形 (1,4,7)（T细胞富集、巨噬细胞富集、脉管系统）被主动组装。结合CNM分析，该基序可能参与有效的抗肿瘤应答。

DII组：三角形 (1,3,4)（T细胞富集、免疫浸润基质、巨噬细胞富集）被主动组装。CNM分析表明该组合与T细胞抑制信号相关，可能是一个抑制性基序。

肿瘤插入关键基序与患者生存恶化直接相关：

一个关键的临床发现是：在CLR组中主动组装的、具有潜在效应功能的三角形 (1,4,7)，在DII组中常被肿瘤核心（cn2）插入，形成四节点基序 cn2-三角形(1,4,7)（即肿瘤与T细胞富集区相邻并加入该三角形）。

生存分析显示：在DII患者中，存在至少一个cn2-三角形(1,4,7)基序实例的患者，其生存期显著短于不存在该基序的DII患者。即使该基序的所有次级子组件（二链或三链）均与生存无显著关联，这表明该四节点基序具有其子组件所不具备的、影响临床预后的涌现功能。

当将该基序的存在与cn9（粒细胞富集区）的功能状态（PD-1+ CD4+ T细胞频率）一起纳入生存模型时，两者均为高度显著的独立预测因子，且效应互补（一负一正）。

肿瘤对架构的“重编程”：研究表明，肿瘤（cn2）可以通过主动整合到宿主原本用于有效免疫应答的基序（如三角形(1,4,7)）中，从而“劫持”或“破坏”该架构，形成对患者有害的微环境状态。

总结

通过对CRC iTME的高阶组装分析，本研究确立了以下几点：

普遍性：CNs局部过程在SCs中相互作用产生涌现信号，是跨组织类型和尺度的普遍功能特征。

主动性：复杂基序并非简单统计涌现，而是存在特定的、被主动组装的高阶基序。

涌现性：高阶基序具有其简单子组件所不具备的独特功能角色。

临床相关性：高阶基序的特定组装方式（尤其是被肿瘤插入后）能够直接影响患者预后。

这项工作不仅为理解肿瘤免疫微环境的复杂空间组织提供了新框架，也指出了特定的高阶空间组装模式作为潜在的新型预后标志物和治疗靶点的可能性。

方法部分我们来看看CN识别

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