​​点成干货 | 蛋白质浓度测定之双缩脲法（Biuret法）如何操作？

1. 实验原理

双缩脲法，是生物化学中经典的蛋白质定量方法之一。其原理基于双缩脲反应：在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键（-CO-NH-）能与铜离子（Cu²+）结合，形成紫色的络合物。

双缩脲生成反应式

此络合物在540 nm波长处有特征吸收峰，且在一定浓度范围内（通常为1-20 mg/mL），其吸光度值与蛋白质浓度呈良好的线性关系。一个重要的特点是，该方法的显色强度与蛋白质的氨基酸组成无关，而主要取决于肽键的数量，因此对不同蛋白质产生的颜色深浅相近。

二、方法优缺点​

优点：

1. 干扰物相对较少：对于不同蛋白质，显色差异小，结果稳定性较好。
2. 操作简便快捷：反应时间较短（约20-30分钟），适合快速测定。
3. 成本较低：所需试剂简单、经济。

缺点：

1. 灵敏度较低：测定范围通常在1-20 mg/mL，不适用于低浓度蛋白质样品。
2. 易受特定物质干扰：如溶液中含有铵离子（如硫酸铵）、Tris缓冲液等，会对测定结果产生干扰。

三、实验器材与试剂​​​

1. 实验器材

• 分光光度计或酶标仪
• 恒温水浴锅（或干浴器）
• 涡旋混匀器
• 微量移液器及移液头
• 试管及试管架
• 比色皿（玻璃或塑料）

2. 主要试剂

• 标准蛋白质溶液：常用牛血清白蛋白（BSA）配制，如10 mg/mL的储备液。
• 双缩脲试剂：为含有硫酸铜、酒石酸钾钠的碱性溶液。
• 待测蛋白溶液：需预实验稀释至标准曲线范围内。

四、实验操作步骤​​​

1. 标准曲线制备：取一系列洁净试管，按下表精确加入试剂，并设置空白管与待测管。

2. 混匀与孵育：将所有试管盖紧后，使用涡旋混匀器充分混匀，随后置于预热的恒温水浴锅中，​​37℃精确孵育20分钟。

3. 测定吸光度：孵育结束后，将溶液倒入比色皿，使用分光光度计，在540 nm波长下，以空白管调零，分别测定各管的吸光度值（A540）。

4. 计算浓度：以标准蛋白浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。将待测样品的A540值代入标准曲线，即可计算出其蛋白质浓度。

五、蛋白质定量中的关键应用设备

在以上实验流程中，关键设备的性能直接影响结果的准确性与重复性。点成的相关实验室设备可为双缩脲法测定提供稳定支持：

涡旋混匀环节：点成MSV-3500数字式涡旋混匀器，转速可调（300-3500 rpm），能确保试剂与样品在加入后瞬间充分混匀，为反应提供均一的起点，避免因混合不均引入误差。

恒温孵育环节：点成QB系列干浴器，控温精确（如±0.1°C），加热块间温度均一性好，能为双缩脲反应提供稳定可靠的37℃环境，保证每批反应条件一致。

吸光度检测环节：点成DEN-600光度计能够为540 nm波长的测量提供快速、准确的吸光度读数，是完成定量的可靠工具。

结语

双缩脲法作为一种经典、经济的蛋白质定量方法，在需要快速测定较高浓度蛋白质的场景中仍有其应用价值。选择操作简便、性能稳定的实验设备，是获得可靠数据的重要保障。

https://dichbio.com/https://dichbio.com/